Shanghan Vi Duotang Yimiao

Vi Polysaccharide Typhoid Vaccine

本品系用伤寒沙门菌培养液纯化的Vi多糖，经用PBS稀释制成。用于预防伤寒。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  菌种

　　生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.1  名称及来源

　　生产用菌种为伤寒沙门菌Ty2株，CMCC 50098。

　　2.1.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.3  种子批的传代

　　主种子批启开后传代次数不得超过5代。工作种子批启开后至接种发酵罐培养传代次数不得超过5代。

　　2.1.4  种子批的检定

　　2.1.4.1  培养特性

　　菌种接种于pH7.2～7.4的肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜的培养基35～37℃培养16～20小时，应为无色半透明、边缘整齐、表面光滑湿润的圆形菌落。

　　2.1.4.2  染色镜检

　　应为革兰氏阴性杆菌。

　　2.1.4.3  生化反应

　　发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖（通则3605）；氧化酶试验阴性。

　　2.1.4.4  血清学试验

　　（1）  玻片凝集试验

　　菌种的新鲜培养物与Vi及H-d参考血清有强凝集反应（+++以上），与Ｏ-9参考血清不产生凝集或仅有较弱凝集反应。

　　（2） 定量凝集试验

　　菌种的新鲜培养物，用PBS制成6.0×108/ml的菌悬液，加入终浓度为0.5%的甲醛溶液，杀菌后的菌液（或直接用活菌菌液）与伤寒Vi参考血清做定量凝集试验；另取经100℃ 30分钟加热杀菌的菌液，与伤寒Ｏ参考血清做定量凝集试验。出现（+）凝集之血清最高稀释度为凝集反应效价，凝集效价应不低于参考血清原效价之半。

　　2.1.5  种子批的保存

　　种子批应冻干保存于8℃及以下。

　　2.2  原液

　　2.2.1  生产用种子

　　启开工作种子批菌种，检定培养特性及染色镜检合格后，接种于改良半综合培养基或其他适宜培养基，制备数量适宜的生产用种子。

　　2.2.2  生产用培养基

　　采用改良半综合培养基或经批准的其他培养基。培养基不应含有与十六烷基三甲基溴化铵能形成沉淀的成分。

　　2.2.3  培养

　　采用培养罐液体培养。在培养过程中及杀菌前取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。

　　2.2.4  收获及杀菌

　　培养物于对数生长期的后期或静止期的前期收获。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，杀菌条件以确保杀菌完全又不损伤其多糖抗原为宜。

　　2.2.5  纯化

　　2.2.5.1  去核酸

　　将已杀菌的培养物，离心去菌体后收集上清液，采用十六烷基三甲基溴化铵沉淀收集复合多糖。

　　2.2.5.2  沉淀多糖

　　取2.2.5.1的上清液，加入乙醇溶液沉淀多糖，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖应保存在－20℃以下，待纯化。

　　2.2.5.3  多糖纯化

　　将粗制多糖溶解于醋酸钠溶液中，用冷苯酚提取，离心收集上清液，并用适宜溶液透析或超滤；加入乙醇沉淀，沉淀物用无水乙醇及丙酮分别洗涤，用灭菌注射用水溶解，除菌过滤后即为多糖原液。提取过程应尽可能在15℃以下进行。

　　2.2.6  原液检定

　　按3.1项进行。

　　2.2.7  保存及有效期

　　于－20℃以下保存。自收获杀菌之日起，疫苗总有效期应不超过60个月。

　　2.3  半成品

　　2.3.1  配制

　　用适宜稀释剂稀释原液，可加入适量抑菌剂。每1次人用剂量含多糖应不低于30μg。

　　2.3.2  半成品检定

　　按3.2项进行。

　　2.4  成品

　　2.4.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.2  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.3  规格

　　每瓶5ml（10次人用剂量）、1ml（2次人用剂量）、0.5ml（1次人用剂量）。每1次人用剂量0.5ml，含多糖应不低于30μg。

　　2.4.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

3.1  原液检定

　　3.1.1  鉴别试验

　　采用免疫双扩散法（通则3403），本品与伤寒Vi血清48小时内应形成明显沉淀线，而与伤寒Ｏ血清不形成沉淀线。

　　3.1.2  化学检定

　　3.1.2.1  固体总量

　　依法测定（通则3101）。

　　3.1.2.2  蛋白质含量

　　应小于10mg/g（通则0731第二法）。

　　3.1.2.3  核酸含量

　　应小于20mg/g，核酸在波长260nm处的吸收系数（）为200（通则0401）。

　　3.1.2.4  Ｏ-乙酰基含量

　　应不低于2.0mmol/g（通则3117）。

　　3.1.2.5  多糖分子大小分布测定

　　多糖分子的KD值在0.25以前的洗脱液多糖回收率应在50%以上（通则3420）。

　　3.1.2.6  苯酚残留量

　　应不高于0.1g/L（通则3113）。

　　3.1.3  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.1.4  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），应符合批准的要求。

　　3.2  半成品检定

　　无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3  成品检定

　　3.3.1  鉴别试验

　　按3.1.1项进行。

　　3.3.2  物理检查

　　3.3.2.1  外观

　　应为无色澄明液体，无异物。

　　3.3.2.2  装量

　　依法检查（通则0102），应不低于标示量。

　　3.3.2.3  渗透压摩尔浓度

　　依法检查（通则0632），应符合批准的要求。

　　3.3.3  化学检定

　　3.3.3.1  pH值

　　应为6.5～7.5（通则0631）。

　　3.3.3.2  抑菌剂含量

　　如添加苯酚作抑菌剂，其含量应不高于1.5mg/剂（通则3113）。

　　3.3.3.3  多糖含量

　　称取0.5～0.6g琼脂糖，加入0.05mol/L巴比妥缓冲液（pH 8.6）40ml中，加热溶胀完全，待冷却至约56℃时，加入伤寒Vi血清1ml，混匀后迅速倾倒于12cm×6cm的洁净水平玻板上，待凝胶凝固后用直径3mm的打孔器在距底边1.5cm处打孔。各孔中分别加入各稀释好的伤寒Vi抗原标准品溶液（浓度分别为：100μg/mL、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml）和本品5μl（本品做双孔）。靠近边缘一孔中，可加入10μl溴酚蓝指示液。加样后将玻板置于电泳槽上，滤纸搭桥，加样端与电泳仪阴极相连。采用0.05mol/L巴比妥缓冲液（pH8.6）为电极缓冲液，8V/cm恒压电泳至指示剂迁移到前沿。取下玻板浸泡于0.85%～0.90%氯化钠溶液1～2小时后，覆盖洁净滤纸移至培养箱中过夜烤干。用考马斯亮蓝染色液染色至火箭峰出现，用甲醇-醋酸溶液脱色至背景清晰。准确测量火箭峰高，以标准品浓度的对数和相应的峰高作直线回归，得直线回归方程，将本品的峰高均值代入直线回归方程，求岀本品浓度。每1次人用剂量多糖含量应不低于30μg。

　　3.3.3.4  Ｏ-乙酰基含量

　　每1次人用剂量应为0.061～0.091μmol（通则3117）。

　　3.3.4  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3.5  异常毒性检查

　　依法检查（通则1141），应符合规定。

　　3.3.6热原检查

　　依法检查（通则1142），注射剂量按家兔体重每1kg注射0.025μg多糖，应符合规定。

　　3.3.7  细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），应符合批准的要求。

于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为24个月。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9