Gouduanluoxuanti Yimiao

Leptospira Vaccine

本品系用各地区主要的钩端螺旋体流行菌型的菌株，经培养、杀菌后，制成单价或多价疫苗。用于预防钩端螺旋体病。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  菌种

　　生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.1  名称及来源

　　主要生产用菌种如下：

　　2.1.2  生产用菌种的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。

　　2.1.3  生产用菌种的检定

　　生产用菌种应先通过体重120~220g的豚鼠传代，2~3天后或豚鼠濒死前抽取其心血或摘取肝组织，接种生产用培养基或其他适宜培养基，并培养4代以上方可进行各项检定。

　　2.1.3.1  形态及培养特性

　　将菌种接种于生产用培养基，接种量在5%以下，28~32C培养5~10天，培养物在显微镜下放大400倍观察，钩端螺旋体菌数为每视野100条以上。培养物应透明，微带乳光，摇动时稍有云雾状浑浊，菌形整齐、运动良好、两端形成钩状。

　　2.1.3.2  血清凝集试验

　　用培养3~10天的活培养物，在显微镜下放大400倍观察，钩端螺旋体菌数为每视野50~100条，运动良好，且无自凝，与参考血清做定量凝集反应，其凝集效价应达血清原效价之半。终点效价以菌数减少50%（++）为判定标准。新菌种要求用凝集素交叉吸收试验法定型。

　　2.1.3.3  分子鉴别试验

　　以各株钩体基因组总DNA为模板，分别进行glmU（上游引物5'-AGGATAAGGTCGCTGTGGTA-3'和下游引物5'-AGTTTTTTTCCGGAGTTTCT-3'，PCR产物为650bp）、pntA（上游引物5'-TAGGAAAGATGAAACCAGGAAC-3'和下游引物5'-AAGAAGCAAGATCCACAACTAC-3'，PCR产物为621bp）、pfkB（上游引物5'-CGGAGAGTTTTATAAGAAGGACAT-3'和下游引物5'-AGAACACCCGCCGCAAAACAAT-3'，PCR产物为588bp）、caiB（上游引物5'-CAACTTGCGGACATAGGAGGAG-3'和下游引物5'-ATTATGTTCCCCGTGACTCG-3'，PCR产物为650bp）、sucA（上游引物5'-TCATTCCACTTCTAGATACGAT-3'和下游引物5'-TCTTTTTTGAATTTTTGACG-3'，PCR产物为640bp）、tpiA（上游引物5'-TTGCAGGAAACTGGAAAATGAAT-3'和下游引物5'-GTTTTACGGAACCACCGTAGAGAAT-3'，PCR产物为639bp）和mreA基因（上游引物5'-GGCTCGCTCTCGACGGAAA-3'和下游引物5'-TCCAAACTCATAAACGACAAAGG-3'，PCR产物为719bp）7种管家基因的PCR扩增，进行多序列位点分析（MLST）。反应条件均为：95℃预变性2分钟；然后95℃变性10秒，46℃ 15秒，72℃延伸30秒，循环30次；72℃再延伸10分钟。

　　确认待检疫苗株在各管家基因PCR扩增目标位置出现阳性产物后，然后进行正、反方向测序和分析，待检钩体各疫苗株应与其原始菌种的ST基因型相同。

　　2.1.3.4  毒力试验

　　用体重180~220g的豚鼠6只，分成两组，每只豚鼠经皮下注射已培养5~10天、在显微镜下放大400倍观察菌数为每视野50~100条活的待检培养物2ml。其中一组于注射后48小时抽取心血，按1%量接种生产培养基或其他适宜培养基2支，培养14天，镜检呈阳性（生长钩端螺旋体），即属弱毒菌株；另一组于注射后观察10天，至少应有2只豚鼠因患钩端螺旋体病死亡，即属强毒菌株。

　　对于传代保存的已知的弱毒或强毒株菌种，也分别按上述相应方法进行，符合弱毒株或强毒株规定者为合格。

　　2.1.3.5  免疫力试验

　　用培养5~10天的活培养物，在显微镜下放大400倍观察菌数，每视野钩端螺旋体为70~100条，将该培养物于56~58℃加温1小时或以3.0g/L苯酚杀菌，以0.85%~0.90%氯化钠溶液做3倍稀释，取体重120~220g豚鼠3只（同时饲养3只豚鼠作为对照组），皮下免疫2次，第1次0.5ml，第2次1ml，间隔5天，末次注射后10~12天，用同株或同型异株培养5~10天、在显微镜下放大400倍观察菌数为每视野50~100条的培养物2ml进行皮下攻击。

　　强毒株：攻击后观察10天，免疫组豚鼠应健存，外观及食欲正常，不耸毛，运动活泼，体重增加，解剖无黄疸。对照组豚鼠至少应有2只患钩端螺旋体病死亡，判为合格。

　　弱毒株：攻击后，24小时抽取心血，取2管5%~8%兔血清培养基，每管4~5ml，各加1~2滴心血（约为1%接种量）。培养14天。免疫组2/3以上为阴性，对照组均为阳性，判为合格。

　　2.1.3.6  抗原性试验

　　用培养5~10天的活培养物，在显微镜下放大400倍观察菌数，每视野钩端螺旋体为70~100条，将该培养物于56~58℃加温1小时或以3.0g/L苯酚杀菌，静脉免疫体重2.0~2.5kg家兔3只，共注射3次，间隔5天，第1次1ml、第2次2ml、第3次5ml，末次注射后10~15天取家兔血清与同株培养物做凝集反应，至少有2只家兔血清效价达到1:10 000以上判为合格。

　　2.1.4  菌种传代及保存

　　2.1.4.1  菌种传代

　　为保存菌种的毒力及纯度，每传3~6代，应通过体重120~220g豚鼠传代一次，并同时做血清学特性检查和生物学特性检查，合格方可作为保存菌种。

　　2.1.4.2  菌种保存

　　菌种应保存于含兔血清培养基或其他适宜培养基内，于18~22℃避光定期传代保存或液氮保存。

　　2.2  原液

　　每种血清型使用1个菌株。

　　2.2.1  生产用种子

　　生产用菌种经培养5~10天生长良好后，取2ml培养液，皮下注射体重120~220g的豚鼠，2~3天后或动物濒死前取心血（或摘取肝组织），按不高于1%的量接种于生产用培养基或其他适宜培养基，28~32℃培育7~18天（不易生长的菌株可延至30天），经纯菌检查及血清学特性检查合格后，再于生产用培养基或其他适宜培养基连续传代至少4次，经检查为生长良好、运动活泼的纯培养物方可用于大量接种。

　　液氮保存的菌种复苏后即可用于生产。

　　2.2.2  生产用培养基

　　采用综合培养基或其他适宜培养基。

　　2.2.3  培养

　　采用大瓶或大罐通气培养，在显微镜下放大400倍观察，菌数应达300条以上。取样做纯菌检查及镜检，应无杂菌。培养物可用适宜的方法浓缩。

　　2.2.4  浓度测定

　　采用显微镜计数法测定菌数。

　　2.2.5  杀菌

　　培养物用苯酚（含量应不高于3.0g/L）或其他适宜杀菌剂杀菌。至少放置30分钟，取样镜检杀菌情况。大罐培养亦可先合并后杀菌。原液如放置半年以上，合并前应逐瓶做无菌检查。

　　2.2.6  原液检定

　　按3.1项进行。

　　2.2.7  原液保存

　　应于2~8℃保存。

　　2.3  半成品

　　2.3.1  配制

　　2.3.1.1  杀菌后的原液按预定比例将不同菌型培养物混合成1批。

　　2.3.1.2  疫苗所含菌型应按当地主要流行菌型配制，5价以下（含5价）者，每型含菌数应不低于1.5×108条/ml；6价（含6价）以上，每型含菌数应不低于1.0×108条/ml。各型比例不应超过或低于计算量的10%，疫苗的总菌数应不超过1.25×109条/ml。

　　2.3.1.3  加入氯化钠，使其最终含量为8.5g/L。

　　2.3.2  半成品检定

　　按3.2项进行。

　　2.4  成品

　　2.4.1  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.2  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.3  规格

　　每瓶5ml。

　　2.4.4  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

3.1  原液检定

　　3.1.1  苯酚测定

　　应不高于3.0g/L（通则3113）。

　　3.1.2  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。如大瓶培养应逐瓶做无菌检查。

　　3.2  半成品检定

　　无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。若移至大瓶存放，应按前、中、后抽样做无菌检查。

　　3.3  成品检定

　　3.3.1  鉴别试验

　　采用血清凝集试验，按疫苗所含菌型抗原的抗血清与本品做试管凝集试验，应产生特异性凝集。

　　3.3.2  物理检查

　　3.3.2.1  外观

　　应为微带乳光的悬液，无异臭，无摇不散的凝块及异物。

　　3.2.2  装量

　　依法检查（通则0102），应不低于标示量。

　　3.3  化学检定

　　3.3.1  pH值

　　应为6.4~7.4（通则0631）。

　　3.3.2  氯化钠含量

　　应为7.5~9.50（通则3107）。

　　3.3.3  苯酚含量

　　应不高于3.0g/L（通则3113）。

　　3.3.4  效力测定

　　按疫苗所含菌型价数，用0.85%~0.90%氯化钠溶液将本品稀释成每型含菌数5×107条/ml，按2.1.3.4项进行。

　　3.3.5  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3.6  异常毒性检查

　　依法检查（通则1141），应符合规定。

于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为18个月。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9