Jisuihuizhiyan Jiandu Huoyimiao Tangwan（Ren Erbeiti Xibao）

Poliomyelitis Vaccine in Dragee Candy（Human Diploid Cell），Live

本品系用脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型减毒株分别接种于人二倍体细胞，经培养、收获后制成糖丸。用于预防脊髓灰质炎。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1  生产用细胞

　　生产用细胞为人二倍体细胞（2BS株或经批准的其他人二倍体细胞）。

　　2.1.1  细胞管理及检定

　　应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。

　　每批原液的生产应来自复苏扩增后的同一细胞批。

　　各级细胞库代次应不超过批准的限定代次。

　　2.1.2  细胞制备

　　取工作细胞库中的细胞，经复苏、消化、置适宜温度下静置或旋转培养制备的一定数量并用于接种病毒的细胞为一个细胞批。

　　2.2  毒种

　　2.2.1  名称及来源

　　生产用毒种为脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型减毒株；可用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin纯化株，中Ⅲ2株或经批准的其他毒株。各型Sabin毒株和Pfizer株来源于世界卫生组织（WHO）。

　　2.2.2  种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。

　　2.2.2.1  原始种子

　　Sabin株原始毒种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及中Ⅲ2株均由毒种研制者制备和保存。

　　2.2.2.2  主种子批

　　主种子批Sabin株Ⅰ、Ⅱ型的传代水平应不超过SO+2，Sabin株Ⅲ型应不超过SO+1；中Ⅲ2株由原始毒种在胎猴肾细胞或人二倍体细胞上传1～2代制成的成分均一的一批病毒悬液称为主种子批，传代水平应不超过中Ⅲ22代；Ⅲ型Pfizer株主种子批为RSO 1。

　　2.2.2.3  工作种子批

　　取主种子批毒种在人二倍体细胞上传1～2代制备的组成均一的一批病毒悬液称为工作种子批。原始种子至工作种子批SabinⅠ、Ⅱ型传代不得超过3代（SO+3），SabinⅢ型及其他纯化株包括Pfizer株传代不得超过2代；从原始种子至工作种子批中Ⅲ2株传代次数不得超过3代。

　　2.2.3  种子批毒种的检定

　　除另有规定外，主种子批及工作种子批应进行以下全面检定。

　　2.2.3.1  鉴别试验

　　取适量Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型单价脊髓灰质炎病毒特异性免疫血清与适量病毒供试品混合，置37℃水浴2小时，接种Hep-2细胞或其他敏感细胞，置35～36℃培养，7天判定结果，病毒型别应准确无误。同时设血清和细胞对照，均应为阴性。病毒对照应为阳性。

　　2.2.3.2  病毒滴定

　　采用微量细胞病变法。将毒种做10倍系列稀释，每稀释度病毒液接种Hep-2细胞或其他敏感细胞，置35～36℃培养，7天判定结果。病毒滴度应不低于6.5 lg CCID₅₀/ml。应同时进行病毒参考品滴定。

　　2.2.3.3  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　2.2.3.4  分枝杆菌检查

　　以草分枝杆菌（CMCC 95024）或牛分枝杆菌菌株BCG作为阳性对照菌。取阳性对照菌接种于罗氏固体培养基，于37℃培养3～5天收集培养物，以0.85%～0.90%氯化钠溶液制成菌悬液，采用细菌浊度法确定菌含量，该菌液浊度与中国细菌浊度标准一致时活菌量约为2×107CFU/ml。稀释菌悬液，取不高于100CFU的菌液作为阳性对照。

　　供试品小于1ml时采用直接接种法，将供试品全部接种于适宜固体培养基（如罗氏培养基或Middlebrook 7H10培养基），每种培养基做3个重复；并同时设置阳性对照。将接种后的培养基置于37℃培养56天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。

　　供试品大于1ml时采用薄膜过滤法集菌后接种培养基。将供试品以0.22μm滤膜过滤后，取滤膜接种于适宜固体培养基，同时设阳性对照。所用培养基、培养时间及结果判定同上。

　　2.2.3.5  支原体检查

　　依法检查（通则3301），应符合规定。

　　2.2.3.6  外源病毒因子检查

　　依法检查（通则3302），应符合规定。

　　2.2.3.7  家兔检查

　　取体重为1.5～2.5kg的家兔至少5只，每只注射10ml，其中1.0ml皮内多处注射，其余皮下注射，观察3周，到期存活动物数应不低于80%，无B病毒和其他病毒感染判为合格。家兔在24小时以后死亡，疑有B病毒感染者应尸检，须留神经组织和脏器标本待查，用脑组织做10%悬液，用同样方法接种5只家兔进行检查，观察到期后动物应全部健存。

　　2.2.3.8  免疫原性检查

　　建立或变更主种子批时应确认主种子批的免疫原性，必要时应根据药品注册管理的相关要求开展相应的临床试验。

　　2.2.3.9  猴体神经毒力试验

　　依法检查（通则3305），应符合规定。

　　2.2.3.10  rct特征试验

　　将单价病毒液分别于36.0℃±0.1℃及40.0℃±0.1℃进行病毒滴定，试验设t-对照（生产毒种或已知对人安全的疫苗）。如果病毒液和t-对照在36.0℃±0.1℃的病毒滴度与40.0℃±0.1℃的滴度差不低于5.0 lg，则rct特征试验合格。

　　2.2.3.11  SV40核酸序列检查

　　依法检查（通则3304），应为阴性。

　　2.2.4  毒种保存

　　液体毒种需加入终浓度为1mol/L的氯化镁溶液，于－60℃以下保存。

　　2.3  单价原液

　　2.3.1  细胞制备

　　按2.1.2项进行。

　　2.3.2  培养液

　　采用适宜的培养液进行培养。如培养液含新生牛血清，其质量应符合要求（通则3604）。维持液为不含新生牛血清的MEM液或其他适宜维持液。

　　2.3.3  对照细胞外源病毒因子检查

　　依法检查（通则3302），应符合规定。

　　2.3.4  病毒接种和培养

　　将毒种接种细胞，培养至细胞出现完全病变后收获。病毒接种量及培养条件按批准的执行。

　　2.3.5  病毒收获

　　病毒液经澄清过滤，收集于大瓶中，为单一病毒收获液。

　　2.3.6  单一病毒收获液检定

　　按3.1项进行。

　　2.3.7  单一病毒收获液保存

　　于2～8℃保存不超过30天，－20℃保存不超过6个月。

　　2.3.8  单一病毒收获液合并或浓缩

　　同一细胞批制备的单一病毒收获液检定合格可适当浓缩进行合并，经澄清过滤即为单价原液。

　　2.3.9  单价原液检定

　　按3.2项进行。

　　2.3.10  单价原液保存

　　于－20℃保存不超过6个月。

　　2.4  半成品

　　2.4.1   配制

　　单价原液加入终浓度为1mol/L的氯化镁，即为单价疫苗半成品。取适量Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型单价疫苗半成品，按一定比例进行配制，即为三价疫苗半成品。

　　2.4.2  半成品检定

　　按3.3项进行。

　　2.5  成品

　　2.5.1  疫苗糖丸制备

　　三价疫苗半成品及赋形剂按一定比例混合后制成糖丸。赋形剂成分包括还原糖浆、糖浆、脂肪性混合糖粉和糖粉。滚制糖丸时，操作室内温度应在18℃以下。

　　2.5.2  分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。同一次混合的三价疫苗半成品制备的糖丸为一批，非同容器滚制的糖丸分为不同亚批。

　　2.5.3  分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.5.4  规格

　　每粒1g。每1次人用剂量为1粒，含脊髓灰质炎活病毒总量应不低于5.95 lg CCID₅₀，其中Ⅰ型应不低于5.8 lg CCID₅₀、Ⅱ型应不低于4.8 lg CCID₅₀、Ⅲ型应不低于5.3 lg CCID₅₀。

　　2.5.5  包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

3.1  单一病毒收获液检定

　　3.1.1  病毒滴定

　　按2.2.3.2项进行。病毒滴度应不低于6.5 lg CCID₅₀/ml。

　　3.1.2   无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.1.3  支原体检查

　　依法检查（通则3301），应符合规定。

　　3.2  单价原液检定

　　3.2.1  鉴别试验

　　按2.2.3.1项进行。

　　3.2.2  病毒滴定

　　按2.2.3.2项进行。病毒滴度应不低于6.5 lg CCID₅₀/ml。

　　3.2.3  猴体神经毒力试验

　　依法检查（通则3305），应符合规定。

　　3.2.4  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.2.5  支原体检查

　　依法检查（通则3301），应符合规定。

　　3.3  半成品检定

　　3.3.1  病毒滴定

　　按2.2.3.2项进行。三价疫苗病毒滴度应不低于7.15 lg CCID₅₀/ml，其中Ⅰ型应不低于7.0 lg CCID₅₀/ml，Ⅱ型应不低于6.0 lg CCID₅₀/ml，Ⅲ型应不低于6.5 lg CCID₅₀/ml。

　　3.3.2  无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.4  成品检定

　　每个糖丸滚制容器取200～300粒。

　　3.4.1  鉴别试验

　　取适量Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三价混合脊髓灰质炎病毒特异性免疫血清与适量供试品混合，置37℃水浴2小时，接种Hep-2细胞或其他敏感细胞，置35～36℃培养，7天判定结果，应无病变出现。同时设血清和细胞对照，均应为阴性。病毒对照应为阳性。

　　3.4.2  外观

　　应为白色固体糖丸。

　　3.4.3  丸重差异

　　取糖丸20粒测定，每1粒重量为1g±0.15g。

　　3.4.4  病毒滴定

　　每3～4亚批合并为1个检定批，取100粒糖丸，加Earle's液至1000ml，即为1∶10稀释度，采用细胞病变法进行病毒滴定。

　　三价疫苗糖丸以混合法测定病毒含量，同时应以中和法检测各型病毒含量。采用中和法需预先精确测定异型抗体的交叉抑制值，以校正滴定结果。按2.2.3.2项测定病毒滴度，每剂三价疫苗糖丸病毒总量应不低于5.95 lg CCID₅₀，其中Ⅰ型应不低于5.8 lg CCID₅₀；Ⅱ型应不低于4.8 lg CCID₅₀；Ⅲ型应不低于5.3 lg CCID₅₀。

　　3.4.5  热稳定性试验

　　热稳定性试验应由生产单位在成品入库前取样测定，应与病毒滴定同时进行。37℃放置48小时后，按2.2.3.2项进行病毒滴定，病毒滴度应不低于5.0 lg CCID₅₀，病毒滴度下降应不高于1.0 lg。

　　3.4.6  病毒分布均匀度

　　每批抽查糖丸10粒以上，测定疫苗糖丸的病毒分布均匀度。逐粒滴定病毒含量，各粒之间的病毒含量差不得超过0.5 lg。

　　3.4.7  微生物限度检查

　　同一天滚制的糖丸为1个供试品，每个糖丸滚制容器中取样不得少于10粒，按微生物计数法检测，每粒菌数不得超过300个（通则1105、通则1106与通则1107）。

　　3.4.8  致病菌检查

　　不得含有乙型溶血性链球菌、肠道致病菌以及大肠埃希菌。

　　3.4.8.1  乙型溶血性链球菌检查

　　取经10倍稀释供试品0.5ml，接种肉汤培养基1支，置37℃培养24小时，再用划线法移种血平皿1个，37℃培养24小时，应无乙型溶血性链球菌生长（如原材料、辅料已做过此项检查并合格，成品可不再做）。

　　3.4.8.2  肠道致病菌检查

　　取经10倍稀释的供试品1.0ml，接种GN或肉汤增菌培养基1管，置37℃培养，于20～24小时内用划线法转种鉴别培养基平皿1个，37℃培养24小时，如有革兰氏阴性杆菌，应进一步鉴定是否为肠道致病菌。

　　3.4.8.3  大肠埃希菌检查

　　取经10倍稀释的供试品，接种普通克斯列或麦康凯肉汤培养基3管，每管2ml，置37℃培养48小时，不应有产酸、产气现象。如有产酸、产气现象，应进一步鉴别是否为大肠埃希菌。

自生产之日起，于－20℃以下保存，有效期为24个月；于2～8℃保存，有效期为5个月。生产日期为糖丸制造日期。运输应在冷藏条件下进行。标签上只能规定一种保存温度和有效期。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9