Ren Cuhongsu Zhusheye

Human Erythropoietin Injection

本品系由高效表达人红细胞生成素（简称人促红素）基因的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后获得的人促红素制成。含适宜稳定剂，不含抑菌剂和抗生素。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1　工程细胞

　　2.1.1　名称及来源

　　人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr-（二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞）细胞系。

　　2.1.2　细胞库建立、传代及保存

　　由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。各级细胞库细胞传代应不超过批准的代次。细胞冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。

　　2.1.3　主细胞库及工作细胞库细胞的检定

　　应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。

　　2.1.3.1　外源因子检查

　　细菌和真菌、支原体、病毒检查均应为阴性。

　　2.1.3.2　细胞鉴别试验

　　应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。

　　2.1.3.3　人促红素表达量

　　应不低于原始细胞库细胞的表达量。

　　2.1.3.4　目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）

　　目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。

　　2.2　原液

　　2.2.1　细胞的复苏与扩增

　　从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能新生牛血清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。新生牛血清的质量应符合规定（通则3604）。

　　2.2.2　生产用细胞培养液

　　生产用细胞培养液应不含牛血清和任何抗生素。

　　2.2.3　细胞培养

　　细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。

　　2.2.4　分离纯化

　　收集的培养液按经批准的纯化工艺进行，采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的人促红素，除菌过滤后即为人促红素原液。如需存放，应规定时间和温度。

　　2.2.5　原液检定

　　按3.1项进行。

　　2.3　半成品

　　2.3.1　配制与除菌

　　原液加入适宜稳定剂，并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。

　　2.3.2　半成品检定

　　按3.2项进行。

　　2.4　成品

　　2.4.1　分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.4.2　分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。

　　2.4.3　规格

　　2000IU/瓶；3000IU/瓶；10000IU/瓶

　　2.4.4　包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。

3.1　原液检定

　　3.1.1　蛋白质含量

　　用4g/L碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5～2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长276～280nm处，测定供试品溶液最大吸光度A_max，将A_max对应波长代入回归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A_光散射。按下式计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。

　　3.1.2　生物学活性

　　3.1.2.1　体内法

　　依法测定（通则3522）。

　　3.1.2.2　体外法

　　按酶联免疫吸附法试剂盒说明书测定。

　　3.1.3　体内比活性

　　每1mg蛋白质应不低于1.0×10⁵IU。

　　3.1.4　纯度

　　3.1.4.1　电泳法

　　依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶的胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。

　　3.1.4.2　高效液相色谱法

　　依法测定（通则0512）。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm，粒度10μm，直径7.5mm，长30cm；流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3；上样量应为20～100μg，在波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算的理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。

　　3.1.5　分子量

　　依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶的胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg ，分子质量应为36～45kD。

　　3.1.6　紫外光谱

　　依法测定（通则0401），用水或0.85%～0.90%氯化钠溶液将供试品稀释至0.5～2mg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，其最大吸收峰应为279nm±2nm；最小吸收峰应为250nm±2nm；在320～360nm处应无吸收峰。

　　3.1.7　等电聚焦

　　取尿素9g、30%丙烯酰胺单体溶液6.0ml、40%pH3～5的两性电解质溶液1.05ml、40%pH3～10的两性电解质溶液0.45m1、水13.5ml，充分混匀后，加入N，N，N'，N'-四甲基乙二胺15μl和10%过硫酸铵溶液0.3ml，脱气后制成凝胶，加供试品溶液20μl（浓度应在每1ml含0.5mg以上），照等电聚焦电泳法（通则0541第六法）进行，同时做对照。电泳图谱应与对照品一致。

　　3.1.8　唾液酸含量

　　每1mol人促红素应不低于10.0mol（通则3102）。

　　3.1.9　外源性DNA残留量

　　每10000IU人促红素应不高于l00pg（通则3407）。

　　3.1.10　CHO细胞蛋白质残留量

　　用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于蛋白质总量的0.05%。

　　3.1.11　细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），每10000IU人促红素应小于2EU。

　　3.1.12　牛血清白蛋白残留量

　　依法测定（通则3411），应不高于蛋白质总量的0.01%。

　　3.1.13　肽图

　　供试品经透析、冻干后，用1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定（通则3405），其中加入胰蛋白酶（序列分析纯），37℃±0.5℃保温6小时，色谱柱为反相C8柱（25cm×4.6mm，粒度5μm，孔径30nm），柱温为45℃±0.5℃；流速为每分钟0.75ml；进样量为20μl；按下表进行梯度洗脱（表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液）。

　　肽图应与人促红素对照品一致。

　　3.1.14　N端氨基酸序列（至少每年测定1次）

　　用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。

　　3.2　半成品检定

　　3.2.1　细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），每1000IU人促红素应小于2EU。

　　3.2.2　无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3　成品检定

　　3.3.1　鉴别试验

　　按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。

　　3.3.2　物理检查

　　3.3.2.1　外观

　　应为无色澄明液体。

　　3.3.2.2　可见异物

　　依法检查（通则0904），应符合规定。

　　3.3.2.3　装量

　　依法检查（通则0102），应不低于标示量。

　　3.3.3　化学检定

　　3.3.3.1　pH值

　　依法测定（通则0631），应符合批准的要求。 

　　3.3.3.2　人血白蛋白含量[1]

　　若制品中加入人血白蛋白作稳定剂，则应符合经批准的要求（通则0731第二法）。

　　3.3.3.3　渗透压摩尔浓度

　　依法测定（通则0632），应符合批准的要求。

　　3.3.4　生物学活性

　　3.3.4.1　体外法

　　按酶联免疫吸附法试剂盒说明书测定，应为标示量的80%-120%。

　　3.3.4.2　体内法

　　依法测定（通则3522），应为标示量的80%～140%。

　　3.3.5　无菌检查

　　依法检查（通则1101），应符合规定。

　　3.3.6　细菌内毒素检查

　　依法检查（通则1143），每1000IU人促红素应小于2EU；5000IU/支以上规格的人促红素，每支应小于10EU。

　　3.3.7　异常毒性检查

　　依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。

于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。

应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

中华人民共和国药典：2020年版.三部/国家药典委员会编. —北京：中国医药科技出版社，2020.5 ISBN 978-7-5214-1575-9