1.1试验项目

　　1.1.1体重

　　1.1.2脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值

　　1.1.3细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验

　　1.1.4体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定

　　1.1.5单核—巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

　　1.1.6 NK细胞活性测定

　　1.2试验原则

　　1.2.1所列指标均为必做项目。

　　1.2.2采用正常或免疫功能低下的模型动物进行实验。

　　1.3结果判定

　　有助于增强免疫力判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有有助于增强免疫力作用。

　　其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核—巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核—巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。

　　1. 实验动物

　　推荐用近交系小鼠，18－22g，单一性别，每组 10－15 只。

　　2. 剂量分组及受试样品给予时间

　　实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的 10 倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。

　　受试样品给予时间 30 天，必要时可延长至 45 天。免疫模型动物实验时间可适当延长。

　　3. 实验方法

　　3.1 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

　　可任选下列方法之一

　　3.1.1 MTT 法

　　3.1.1.1 原理

　　当 T 淋巴细胞受 ConA 刺激后发生母细胞发生增殖反应，活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶，其光密度值能反映细胞的增殖情况。

　　3.1.1.2 仪器和材料

　　RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白 A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's 液、PBS 缓冲液（pH7.2-7.4）纱布或 200 目筛网、24 孔培养板，96 孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721 分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。

　　3.1.1.3 实验步骤

　　3.1.1.3.1 试剂配制

　　完全培养液 RPMI1640 培养液过滤除菌，用前加入 10%小牛血清，1%谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），链霉素（100μg/L）及 5×10－5mol/L 的 2-巯基乙醇，用无菌的 1mol/L 的 HCl 或 1mol/L 的 NaOH调 pH 至 7.0－7.2，即完全培养液。

　　ConA 液 用双蒸水配制成 100μg/mL 的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20℃）保存。

　　无菌 Hank's 液 用前以 3.5%的无菌 NaHCO3调 pH 至 7.2－7.4。

　　MTT 液 将 5mg MTT 溶于 1mL pH7.2 的 PBS 中，现配现用。

　　酸性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入 4mL 1mol/L 的 HCl，临用前配制。

　　3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备

　　无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hank's 液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经 200 目筛网过滤，或用 4 层纱布将脾磨碎，用 Hank's 液洗 2 次，每次离心 10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于 1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95%以上），调整细胞浓度为 3×10⁶个/mL。

　　3.1.1.3.3 淋巴细胞增殖反应

　　将每一份脾细胞悬液分两孔加入 24 孔培养板中，每孔 1mL，一孔加 75μL ConA 液（相当于 7.5μg/mL），另一孔作为对照，置 5%CO₂，37℃ CO₂孵箱中培养 72h。培养结束前 4h，每孔轻轻吸去上清液 0.7mL，加入0.7mL 不含小牛血清的 RPMI1640 培养液，同时加入 MTT（5mg/mL）50μL /孔，继续培养 4h。培养结束后，每孔加入 1mL 酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到 96 孔培养板中，每个孔作 3 个平行孔，用酶标仪，以 570nm 波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入 2mL 比色杯中，721 分光光度计上在波长 570nm 测定 OD 值。

　　3.1.1.4 数据处理及结果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　用加 ConA 孔的光密度值减去不加 ConA 孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。

　　3.1.1.5 注意事项

　　本实验中 ConA 的浓度很重要，过低不能刺激足够的细胞增殖，过高会抑制细胞增殖，不同批号的 ConA在实验前要进行预试，以找到最佳浓度。

　　3.1.2 同位素掺入法

　　3.1.2.1 原理

　　T 淋巴细胞在有丝分裂原 PHA、ConA 等的刺激下，产生增殖反应，DNA 和 RNA 合成明显增加，如在培养液中加入 ³H－胸腺嘧啶核苷（³H-TdR），则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。

　　3.1.2.2 仪器和材料

　　RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白 A（ConA）、Hank's液、PBS 缓冲液（pH7.2-7.4）、³H-TdR、闪烁液[2,5-二苯基恶唑（PPO）0.5g、1,4-双-（5-苯基恶唑基）-苯（POPOP）0.25g、二甲苯 500mL 混匀]200 目筛网，96 孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49 型玻璃纤维滤纸。

　　3.1.2.3 实验步骤

　　3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备

　　无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hank's 液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经 200目筛网过滤，用 Hank's 液洗 3 次，每次离心 10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于 2mL 的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95%以上），最后用 RPMI1640 完全培养液将细胞数调成 5×10⁶个/mL。

　　3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应

　　将脾细胞悬液加入到 96 孔培养板中，200μL/孔，每一份脾细胞悬液分装 6 个孔，3 孔加 ConA（5μg/mL），另 3 个孔不加 ConA 作为对照。置 5% CO₂，37℃培养 72h，培养结束前 6h，每孔加入 ³H-TdR 20μL，使其终浓度为（3.7－18.5）×10⁴Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入 7mL 闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。

　　3.1.2.4 数据处理及结果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示

　　受试样品组的 SI 值显著高于对照组的 SI 值，即可判定该项实验结果阳性。

　　3.2 迟发型变态反应（DTH）

　　可任选下列方法之一

　　3.2.1 二硝基氟苯诱导小鼠 DTH（耳肿胀法）

　　3.2.1.1 原理

　　二硝基氟苯（DNFB）稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7 天后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局部肿胀，一般在抗原攻击后 24～48h 达高峰，其肿胀程度可以反应映迟发型变态反应程度。

　　3.2.1.2 材料

　　DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。

　　3.2.1.3 实验步骤

　　3.2.1.3.1 试剂配制

　　DNFB 溶液 DNFB 溶液应新鲜配制，称取 DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的 5mL 丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用 250μL 注射器通过瓶盖取用。

　　3.2.1.3.2 致敏 每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛或剃毛，范围约 3cm×3cm，用 DNFB 溶液 50μL 均匀涂抹致敏。

　　3.2.1.3.3 DTH 的产生与测定 5 天后，用 DNFB 溶液 10μL 均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24h 颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径 8mm 的耳片，称重。

　　3.2.1.4 数据处理与结果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　用左右耳重量之差表示 DTH 的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。

　　3.2.1.5 注意事项

　　操作时应避免 DNFB 与皮肤接触。

　　3.2.2 绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠 DTH（足跖增厚法）

　　3.2.2.1 原理

　　SRBC 可刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4 天后，当再以 SRBC 攻击时，攻击部位出现肿胀，其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。

　　3.2.2.2 材料

　　游标卡尺（精密度 0.02mm）、SRBC、微量注射器（50μL）。

　　3.2.2.3 实验步骤

　　3.2.2.3.1 致敏 小鼠用 2%（v/v）SRBC 腹腔或静脉注射免疫，每只鼠注射 0.2mL（约 1×10⁸个 SRBC）。

　　3.2.2.3.2 DTH 的产生与测定 免疫后 4 天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射 20%（v/v）SRBC，每只鼠 20μL（约 1×10⁸个 SRBC），注射后于 24h 测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。

　　3.2.2.4 数据处理和结果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　以攻击前后足跖厚度的差值来表示 DTH 的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。

　　3.2.2.5 注意事项

　　测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加压，否则会影响测量结果。

　　攻击时所用的 SRBC 要新鲜（4℃保存期不超过 1 周）。

　　3.3 抗体生成细胞检测（Jerne 改良玻片法）

　　3.3.1 原理

　　经过绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的 SRBC 混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的 SRBC 溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数可反映抗体生成细胞数。

　　3.3.2 仪器和材料

　　二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200 目筛网、SRBC、补体（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640 培养液、SA 缓冲液、琼脂糖。

　　3.3.3 实验步骤

　　3.3.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入 4℃冰箱保存备用，可保存 2 周。

　　3.3.3.2 制备补体 采集豚鼠血，分离出血清（至少 5 只豚鼠的混合血清），将 1mL 压积 SRBC 加入到 5mL豚鼠血清中，4℃冰箱放置 30min，经常振荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以 SA 缓冲液按 1：8 －15 稀释。

　　3.3.3.3 玻片涂膜 在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（0.5g 琼脂糖加双蒸水至 100mL，加热溶解），干后可长期保存备用。

　　3.3.3.4 免疫动物 取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤 3 次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射 SRBC 5×10⁷～2×10⁸个。也可将压积 SRBC 用生理盐水配成 2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射 0.2mL。

　　3.3.3.5 脾细胞悬液制备

　　将 SRBC 免疫 4～5 天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有 Hank's 液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经 200 目筛网过滤，或用 4 层纱布将脾磨碎，离心（1000r/min）10min，用 Hank's 液洗2 遍，最后将细胞悬浮在 5mL RPMI1640 培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为 5x10⁶个/mL。也可将细胞悬浮在 8mL Hank's 液。

　　3.3.3.6 空斑的测定

　　将表层培养基（1g 琼脂糖加双蒸水至 100mL）加热溶解后，放 45～50℃水浴保温，与等量 pH7.2～7.4、2 倍浓度的 Hank's 液混合，分装小试管，每管 0.5mL，再向管内加 50μL 10% SRBC（v/v，用 SA 缓冲液配制），20μL 脾细胞悬液（5×10⁶个/mL）或 25μL 脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育 1～1.5h，然后用 SA 缓冲液稀释的补体（1：8）加入到玻片架凹槽内，继续温育 1～1.5h 后，计数溶血空斑数。

　　3.3.4 数据处理及结果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　用空斑数/10⁵脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。

　　3.4 血清溶血素的测定

　　可任选下列方法之一。

　　3.4.1 血凝法

　　3.4.1.1 原理

　　用 SRBC 免疫动物后，产生抗 SRBC 抗体（溶血素），利用其凝集 SRBC 的程度来检测溶血素的水平。

　　3.4.1.2 仪器和材料

　　SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机

　　3.4.1.3 实验步骤

　　3.4.1.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存 2 周。

　　3.4.1.3.2 免疫动物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤 3 次，每次离心（2000r/min）10min。将压积 SRBC用生理盐水配成 2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射 0.2mL 进行免疫。4～5 天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约 1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min 离心 10min，收集血清。

　　3.4.1.3.3 凝集反应 用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入 100μL 0.5%（v/v）的 SRBC 悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于 37℃温箱孵育 3h，观察血球凝集程度。

　　3.4.1.4 数据处理及结果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　血清凝集程度一般分为 5 级（0－IV）记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对

　　照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。

　　抗体水平＝（S₁+2S₂+3S₃……nS_n）

　　式中 1、2、3……n 代表对倍稀释的指数，S 代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

　　0 级 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。

　　I 级 红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。

　　II 级 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。

　　III 级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。

　　IV 级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。

　　3.4.1.5 注意事项

　　血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。

　　3.4.2 半数溶血值（HC₅₀）的测定

　　3.4.2.1 原理

　　用 SRBC 免疫动物后，血清中出现 SRBC 抗体（溶血素），在补体参与下，与 SRBC 一起孵育，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。

　　3.4.2.2 仪器和材料

　　721 分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体（豚鼠血清）、SA 缓冲液、都氏试剂（碳酸氢钠 1.0g、高铁氰化钾 0.2g、氰化钾 0.05g，加蒸馏水至 1000mL）

　　3.4.2.3 实验步骤

　　3.4.2.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入 4℃冰箱保存备用，可保存 2 周。

　　3.4.2.3.2 制备补体 采集豚鼠血，分离出血清（至少 5 只豚鼠的混合血清），将 1mL 压积 SRBC 加入到 5mL豚鼠血清中，放 4℃冰箱 30min，经常振荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以 SA 液按 1：8 稀释。

　　3.4.2.3.3 免疫动物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤 3 次，每次离心（2000r/min）10min。将压积 SRBC用生理盐水配成 2％（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射 0.2mL 进行免疫。4～5 天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约 1h，使血清充分析出，2000r/min 离心 10min，或 6000r/min，4min，收集血清。

　　3.4.2.3.4 溶血反应

　　3.4.2.3.4.1 分光光度计法 取血清用 SA 缓冲液稀释（一般为 200～500 倍）。将稀释后的血清 1mL 置试管内，依次加入 10%（v/v）SRBC 0.5mL，补体 1mL（用 SA 液按 1:8 稀释）。另设不加血清的对照管（以 SA 缓冲液代替）。置 37℃恒温水浴中保温 15～30min 后，冰浴终止反应。2000r/min 离心 10min。取上清液 1mL，加都氏试剂 3mL，同时取 10%（v/v）SRBC 0.25mL 加都氏试剂至 4mL，充分混匀，放置 10min 后，于 540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。

　　3.4.2.3.4.2 酶标仪法 设样品孔和空白对照孔，样品孔：取血清用 SA 缓冲液稀释（一般 200～500 倍）；每孔加入稀释后的血清 50μL；空白对照孔：每孔加入 50μLSA 缓冲液，再依次加入 10%（v/v）SRBC 25μL，补体 50μL（用 SA 溶液按 1:8 稀释），置 37℃恒温培养箱中保温 30min，冰浴终止反应，1500r/min 水平离心 10min，然后样品孔和空白对照孔各取上清液 50μL 加入另一个 96 孔培养板内，加都氏试剂 150μL。同时设半数溶血孔，加入 10%（v/v）SRBC 12.5μL 再加都氏试剂至 200μL。用震荡器充分混匀，放置 10min 后，于 540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。

　　3.4.2.4 数据处理及结果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　溶血素的量以半数溶血值（HC₅₀）表示，按下列公式计算，受试样品组的 HC₅₀显著高于对照组的 HC₅₀，可判定该项实验结果阳性。

　　3.5 小鼠碳廓清实验

　　3.5.1 原理

　　在一定范围内，体内碳颗粒被清除速率与血碳浓度呈指函数关系。

　　以血碳浓度对数值为纵坐标，时间为横坐标，两者呈直线关系。此直线斜率（K）可表示吞噬速率。动物肝、脾重量影响吞噬速率，一般以校正吞噬指数 a 表示。

　　3.5.2 仪器和试剂

　　721 分光光度计、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na₂CO₃

　　3.5.3 实验步骤

　　3.5.3.1 溶液配制

　　注射用墨汁 将印度墨汁原液用生理盐水稀释 3～4 倍。

　　Na₂CO₃溶液 取 0.1gNa₂CO₃，加蒸馏水至 100mL。

　　3.5.3.2 注射墨汁 按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁（10ml/kg），待墨汁注入，立即计时。

　　3.5.3.3 测定

　　注入墨汁后 2、10min，分别从内眦静脉丛取血 20μL，并立即将其加到 2mL 0.1%Na₂CO₃溶液中。用 721分光光度计在 600nm 波长处测光密度值（OD），以 Na₂CO₃溶液作空白对照，也可用酶标仪在 600nm 波长处测光密度值（OD）。

　　将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。

　　以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数 a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。

　　3.5.4 数据处理及结果判定

　　一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　3.5.5 注意事项

　　静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。

　　墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀。

　　使用新的墨汁时，应在实验前摸索一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在 20min 内不易廓清。

　　3.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

　　可任选下列方法之一。

　　3.6.1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）

　　3.6.1.1 原理

　　利用巨噬细胞对光滑表面如玻璃表面具有粘附的特性，将含有巨噬细胞的腹腔液滴于载玻片上，加入鸡红细胞，孵育一定时间后，冲洗掉未粘附的细胞，固定染色，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。

　　3.6.1.2 仪器和材料：

　　显微镜、37℃孵箱、计数器、手术器械一套、注射器、滴管、胶头吸管、吸耳球、载玻片、染色槽、试管

　　3.6.1.2.1 玻片处理

　　重复使用的载玻片要经洗液浸泡、洗净晾干后，经酒精浸泡过夜。用前以纱布拭干或晾干，否则会影响巨噬细胞粘附和镜检。在玻片上标号，用 3%琼脂（配方见试剂部分）每个玻片上划两个圆圈（圆圈必须全封闭，否则液体会流出），晾干备用。

　　3.6.1.2.2 搪瓷或塑料盒：内垫半湿纱布（用温水湿透，置于孵箱内备用），纱布一定要平整。

　　3.6.1.2.3 试剂配制方法

　　3.6.1.2.3.1 3%琼脂的配制：

　　取琼脂 3g，加水 100mL，加热煮沸至透明，加入 1%的溴甲酚紫指示剂 1－2 滴。

　　3.6.1.2.3.2 PBS 缓冲液的配制方法：

　　KH₂PO₄ 6.66g，Na₂HPO₄·12H₂O 6.38g，将上述试剂溶于 1000mL 蒸馏水中调 pH 值至 7.2 即成。

　　3.6.1.2.3.3 1%鸡红细胞悬液：

　　实验前取鸡颈静脉或动脉血，置于盛有玻璃珠（20 个左右）的三角瓶内，连续顺一个方向充分摇动 5～10min，除去纤维蛋白，4℃冰箱保存。实验前用生理盐水洗涤 3 次， 1500r/min，离心 10min，弃去上清，按血球压积用 Hank’s 液配制成 1%的红细胞悬液

　　3.6.1.2.3.4 Giemsa 染液：

　　a.取 Giemsa 染料 0.5g，中性甘油 33mL，甲醇 33mL。先将 Giemsa 染料置清洁研钵中，加甘油后，研磨片刻，倒入棕色瓶内，放置 55～60℃水浴箱内 2 小时，不断摇匀，再加入甲醇摇匀，保存备用。

　　b.稀释姬姆萨氏染色液：使用时，用 pH6.8 的缓冲液 8 份，加姬姆萨氏染色液原液 1 份，即成应用液。

　　3.6.1.2.3.5 Giemsa 染液脱色液：配制方法：甲醇 20mL，蒸馏水 80mL。混合后加 2N HCl₂滴即成。

　　3.6.1.3 实验步骤

　　小鼠巨噬细胞的激活:实验前 4 天给每只小鼠腹腔注射 2%压积羊血红细胞 0.2mL。用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的 Hank's 液 4mL/只，轻轻按揉腹部 20 次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液 2mL 于试管内（或用注射器）。用 1mL 加样器吸取腹腔洗液 0.5mL加入盛有 0.5mL 1%鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器（装大针头）吸取 0.5mL 混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱内 37℃孵育 15－20 分钟。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定 1 分钟，Giemsa 液染色 15 分钟。用蒸馏水冲洗干净，晾干，用 40×显微镜计数吞噬率和吞噬指数。

　　吞噬率为每 100 个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。

　　3.6.1.4 数据处理及结果判定

　　见 3.6.2.4. 

3.6.1.5 注意事项

　　颈椎脱臼处死小鼠勿用力过大，防止腹腔内血管和内脏破裂出血影响实验结果。

　　放滴片的搪瓷盘内应保持一定的湿度，以防液体干燥。

　　孵育后的标本冲洗次数的差别不宜太大，更不要直接冲在有细胞的部分。

　　实验操作过程中应严格掌握时间。

　　在镜下计数细胞时要数完一个视野后再换另一个视野。

　　3.6.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）

　　3.6.2.1 原理

　　在体内腹腔巨噬细胞能吞噬鸡红细胞。据此判断巨噬细胞的吞噬功能。

　　3.6.2.2 仪器和材料

　　显微镜、鸡红细胞、丙酮、甲醇、生理盐水、Giemsa 染液。

　　3.6.2.3 实验步骤

　　3.6.2.3.1 鸡红细胞悬液制备 取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水洗涤 2～3 次，离心（2000r/min，10min），去上清，用生理盐水配成 20%（v/v）的鸡红细胞悬液。

　　3.6.2.3.2 吞噬功能测定 每鼠腹腔注射 20% 鸡红细胞悬液 1mL。间隔 30min－1.5h，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水 2mL，转动鼠板 1min。然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于 2 片载玻片上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移置 37℃孵箱温育 30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以 1:1 丙酮甲醇溶液固定，4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色 3min，再用蒸馏水漂洗晾干。

　　油镜下计数巨噬细胞，每张片计数 100 个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。

　　在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度。借以判定巨噬细胞吞噬与消化功能，通常分为 4 级：

　　I 级：未消化。被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核浅紫色。

　　II 级：轻度消化。胞质浅黄绿色、胞核固缩呈紫蓝色。

　　III 级：重度消化。胞质淡染，胞核淡浅灰色。

　　IV 级：完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。

　　3.6.2.4 数据处理及结果判定

　　以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行数据转换，X＝Sin-¹ √p ，式中 P 为吞噬百分率，用小数表示。在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　受试样品组的吞噬百分率或吞噬指数与对照组比较，差异均有显著性，方可判定该项实验结果阳性。

　　3.7 NK 细胞活性测定

　　可任选下列方法之一

　　3.7.1 乳酸脱氢酶（LDH）测定法

　　3.7.1.1 原理

　　正常情况下，活细胞胞浆内的含有 LDH 不能透过细胞膜，当细胞受到 NK 细胞的杀伤后，LDH 释放到细胞外。LDH 可使乳酸锂脱氢，进而使 NAD 还原成 NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑蓝（INT），INT 接受 H^＋被还原成紫红色甲臜类化合物。在酶标仪上用 490nm 比色测定。

　　3.7.1.2 仪器和材料

　　酶标仪、YAC-1 细胞、Hank's 液（pH7.2～7.4）、RPMI1640 完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、碘硝基氯化四氮唑蓝（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、NAD、0.2mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液（pH8.2）、1%NP40 或 2.5%Triton

　　3.7.1.3 实验步骤

　　3.7.1.3.1 LDH 基质液的配制

　　乳酸锂 5×10^-2mol/L

　　碘硝基氯化四氮唑蓝（INT） 6.6×10^-4mol/L

　　吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS） 2.8×10^-4mol/L

　　氧化型辅酶Ⅰ（NAD） 1.3×10^-3mol/L

　　将上述试剂溶于 0.2mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液中（pH8.2）

　　3.7.1.3.2 靶细胞的传代（YAC-1 细胞）

　　实验前 24h 将靶细胞进行传代培养。用前以 Hank's 液洗 3 次，用 RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。

　　3.7.1.3.3 脾细胞悬液的制备（效应细胞）

　　无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hank's 液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经 200目筛网过滤，或用 4 层纱布将脾磨碎，或用 Hank's 液洗 2 次，每次离心 10min（1000r/min）。弃上清将细胞浆弹起，加入 0.5mL 灭菌水 20 秒，裂解红细胞后再加入 0.5mL2 倍 Hank’s 液及 8mLHank’s 液，1000r/min，10min 离心；或采用 NH4Cl-Tris 红细胞裂解液裂解红细胞，离心 10min（1000r/min），弃红色上清。用 1mL含 10%小牛血清的 RPMI1640 完全培养液重悬，用 1%冰醋酸稀释后计数，用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95%以上），最后用 RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为 2×10⁷个/mL。

　　3.7.1.3.4 NK 细胞活性检测

　　取靶细胞和效应细胞各 100μL（效靶比 50:1），加入 U 型 96 孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和 1%NP40 或 2.5%Triton 各 100μL；上述各项均设三个平行孔，于 37℃、5%CO2培养箱中培养 4h，然后将 96 孔培养板以 1500r/min 离心 5min，每孔吸取上清 100μL 置平底96 孔培养板中，同时加入 LDH 基质液 100μL，根据室温不同反应 3~10min，每孔加入 1mol/L 的 HCl 30μL，在酶标仪 490nm 处测定光密度值（OD）。

　　按下式计算 NK 细胞活性，受试样品组的 NK 细胞活性显著高于对照组的 NK 细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。

　　3.7.1.4 数据处理及结果判定

　　NK 细胞活性需进行数据转换，X＝Sin-¹ √p ，式中 P 为 NK 细胞活性，用小数表示，然后再进行方差分析，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　受试样品组的 NK 细胞活性显著高于对照组的 NK 细胞活性，可判定该项实验结果阳性。

　　3.7.1.5 注意事项

　　靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于 95%。

　　反应时环境温度应保持恒定。

　　LDH 基质液应临用前配制。

　　在一定范围内，NK 细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过 100。

　　3.7.2 同位素 ³H-TdR 测定法

　　1.3.7.2.1 原理

　　将用同位素 ³H-TdR 标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被 NK 细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与 NK 细胞活性成正比。通过测定靶细胞 ³H-TdR 的释放率即可反应 NK细胞的活性。

　　3.7.2.2 仪器和材料

　　液体闪烁仪、多头细胞取集器、二氧化碳培养箱、³H-TdR、RPMI1640 完全培养液、Hank's 液（pH7.2～7.4）、YAC-1 细胞、Triton X-100

　　3.7.2.3. 实验步骤

　　3.7.2.3.1 靶细胞的标记

　　取传代后 24h 生长良好的 YAC-1 细胞（存活率>95%）按 1×10⁶/mL YAC-1 细胞悬液加 ³H-TdR 10uCi 进行标记，于 37℃、5%CO₂培养箱中培养 2h，每 30min 振荡 1 次。标记后的细胞用培养液洗涤 3 次，重悬于培养液中，使细胞浓度为 1×10⁵个/mL。

　　3.7.2.3.2 脾细胞悬液的制备（效应细胞）

　　无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hank's 液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经 200 目筛网过滤，用 Hank's 液洗 3 次，每次离心 10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于 2mL 的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95%以上），最后用 RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为 1×10⁷个/mL。

　　3.7.2.3.3 NK 细胞活性测定

　　在 96 孔培养板中每孔加 100μL 标记的靶细胞，实验孔加 100μL 效应细胞，空白对照孔加 100μL 培养液，最大释放孔加 100μL 2.5% Triton X-100。每个样品设 3 个复孔，置 5%CO₂、37℃培养箱内温育 4h，用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪进行测量。

　　按下式计算 NK 细胞活性：

　　3.7.2.4 数据处理及结果判定

　　NK 细胞活性需进行数据转换，X＝Sin-¹ √p，式中 P 为 NK 细胞活性，用小数表示。在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值<F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值≥F0_.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

　　受试样品组的 NK 细胞活性显著高于对照组的 NK 细胞活性，可判定该项实验结果阳性。

　　4. 有助于增强免疫力结果判定

　　有助于增强免疫力判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK 细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有有助于增强免疫力作用。

　　其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核—巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核—巨噬细胞功能结果阳性。NK 细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定 NK 细胞活性结果阳性。